根據角膜植物損傷史，結合角膜病灶的特征，可作出初步診斷。實驗室檢查找到真菌和菌絲可以確診。常用方法有角膜刮片Gram和Giemsa染色、10％－20％氫氧化鉀濕片刮片及培養均為陰性，而臨床又高度懷疑者，可考慮作角膜組織活檢。此外，免疫熒光染色、電子顯微鏡檢查和PCR技術也用于真菌角膜炎的診斷。角膜共焦顯微鏡作為非侵入性檢查，可直接發現病灶內的真菌病原體。