2.2測定細胞雕亡的方法

加溫引起細胞周期阻滯并引發細胞凋亡，凋亡細胞的定性和定量測定可以作為評定細胞熱效應的客觀指標。

2.2.1  光學顯微鏡下觀察細胞凋亡

凋亡細胞的組織學變化表現為：只發生在單個細胞或幾個細胞而周圍細胞是完好無損的并無炎癥反應表現。在光學顯微鏡下凋亡細胞最主要的變化是核內染色質的濃縮，形成染色質塊，并貼在核的邊緣，呈現月牙形或沙丘狀。進一步則呈分葉狀或花瓣狀，最后分離形成多個核碎片。細胞胞質固縮，體積縮小，細胞表面起泡，成不規則形狀。凋亡小體出現，并可見凋亡小體被周圍巨噬細胞吞噬現象。通過計數凋亡細胞，可以計算凋亡指數 ( apoptotic index )。

2.2.2  流式細胞分析法

流式細胞術（ FCM, flow cytometry ）是對單細胞多項特征進行快速測定的生化技術。其原理為：經過特異的熒光染料染色的單細胞懸液受到一束預定波長的激光照射時可以發出熒光，熒光的強度與所染物質的量成正比，因此，測出熒光強度即可得知所測物質的相對含量，若將受激產生的熒光，經光電倍增管接收放大，并送電子計算機處理即可得出所需參數。細胞經DNA熒光染料（如碘化丙啶）標記后，FCM可測定單個細胞DNA含量，經電子計算機處理可得出細胞群DNA含量的分布圖，亦稱細胞周期直方圖（見圖3.2.1），直方圖的橫坐標表示DNA含量，縱坐標表示細胞出現的頻率，即相對細胞數。左邊第一峰是由G1和G0細胞組成，右邊小峰由G2和M期細胞組成，中間部分是S期細胞。如果在G1峰前出現Sub-G1峰，它是由帶有DNA降解的凋亡細胞組成。經計算機軟件處理可計算出G0/G1、S、G2/M各細胞周期細胞所占比例和Sub-G1凋亡細胞的比例（見表3.2.1）。

將細胞消化后離心，沉淀后用70%冰乙醇固定，于40C下過夜，離心，用PBS液洗2遍，加RNA酶(50ug/ml)、370C作用１小時，再用PI溶液（100ug/ml)染色DNA 30分鐘，在流式細胞儀上進行分析。

2.2.3  DNA片段化分析法 ( DNA ladder )

細胞凋亡的最后通路是細胞染色質DNA特征性的片段化降解。細胞發生凋亡，其DNA的降解不是隨機位點上發生斷裂，而是在兩個核小體 ( nucleosome ) 之間的連接部位發生斷裂。所以這些DNA片段就是在形態學上出現若干大小不一的由180個堿基對的整倍數的寡核苷酸片段組成。因此，從發生細胞程序化死亡的細胞中提取染色體DNA，進行瓊脂糖 ( agarose ) 凝膠電泳時，能觀察到呈不連續但具有特定大小的條帶狀，稱為云梯 ( ladder ) 狀。這是細胞程序化死亡最重要的生物化學特征之一，也是DNA片段化分析法檢測細胞凋亡的原理。該法是先用酸或氯仿提取DNA，再用乙醇沉淀，在明膠板上進行電泳后，用溴化乙錠著色，出現特征性的DNA梯形條帶。此法敏感性不高，需要106個以上細胞。

2.2.4 原位末端標記檢測凋亡效應 ( TUNEL 分析 )

這是一種對單個細胞通過顯示DNA的降解來檢測凋亡的技術，屬于原位末端標記技術（ in situ end labeling techniques, ISEL ）中的一種。該法是對細胞經甲醇固定處理后，滴加轉化劑－POD, 蘇木精復染，用DNAase I 處理細胞，使之產生DNA鏈缺口，再滴加TUNEL反應混合液。以細胞出現棕黃色顆粒為陽性凋亡細胞，每張細胞片選擇3個區在300倍視野下連續計數200個細胞，計算其中凋亡細胞的百分率。

第2章           加溫后的生物學改變

3.2  分子，基因水平

熱療的作用靶是真核細胞的核染色體具有雙螺旋結構的DNA，產生單鏈斷裂（可修復）和雙鏈斷裂（不可修復）。加溫誘導產生的熱休克蛋白70 ( HSP70, heat shock protein )都有促進細胞損傷修復的作用；另一方面，加溫也使細胞內溶酶體酶活性增加，其崩解釋放的消化酶使損傷細胞蛋白消化溶解。加溫誘導產生的腫瘤壞死因子a ( TNFa, tumor necrosis factor )對細胞凋亡起促進作用。加溫尤其是在高溫下，細胞內DNA損傷修復的聚合酶活性下降，使加溫所致DNA損傷修復受阻。加溫產生細胞周期阻滯，由此啟動修復過程，如果細胞損傷不能修復，將引發細胞程序化死亡過程，即凋亡發生。P53抑癌基因對加溫后細胞周期阻滯和凋亡都起著重要的調控作用。

P53基因位于人17號染色體上 （ 17p13.1 ），因編碼一分子量53KD的核磷酸蛋白而得名。P53基因全長約20kb，有11個外顯子，10個內含子，編碼393個氨基酸。P53蛋白有三個結構區：N－末端為酸性區，具有轉錄激活功能，可與許多轉錄因子相互作用；中央疏水區富含脯氨酸具有序列特異性DNA結合特性；C－末端是堿性區，為高活性的關鍵區域，易形成a螺旋和轉角結構，其寡聚區 （ 第319－360氨基酸殘基）所形成的二聚體或四聚體對于p53蛋白與系列特異性DNA的結合而發揮的反式激活功能具有關鍵作用。

P53基因的主要功能：一是作為細胞周期檢查點 ( checkpoint ), 起分子警察的作用。即細胞受損時，DNA損傷可誘導短時間p53基因的表達，p53蛋白可與DNA調控區結合，使CKI基因WAF1/ CIP1( WAF1, wild-type p53 transactivated gene, CIP1, Cdk-interacting protein ) 表達，其產物為p21蛋白，而p21可抑制細胞周期蛋白D激酶 （ CDK ）活性，使cyclin-cdk不能磷酸化pRb，從而阻礙了E2F的釋出，使DNA合成的有關基因不能表達，使細胞不能進入DNA合成的S期，這樣損傷的細胞則停滯在G1期，為細胞DNA的修復創造條件。P53除了誘導和促進G1期阻滯外，還有觀察到對某些細胞的G2期阻滯。P53基因的另一重要功能是誘導細胞凋亡。當細胞DNA損傷不能修復時，p53會誘導細胞進入編程化死亡過程。它可能通過兩種途徑來調控凋亡：一是通過特異性轉錄激活 ( sequence specific transcription activation, SST )方式，p53直接激活死亡基因，如bax，或者抑制存活基因，如bcl-2。Bax 比例上調，和/或bcl-2比例下調，均可促進細胞凋亡。二是p53通過非SST依賴途徑起作用。P53基因對腫瘤組織有抑制作用，一是它可抑制腫瘤細胞生長，二是它可抑制腫瘤血管的生成，其機制可能是p53通過抑制血管內皮生長因子 ( VEGF )的作用有關。

P53基因與腫瘤細胞的熱敏感性密切相關。對于攜帶野生型p53的細胞，加溫后p53表達增加，對加溫引導的凋亡效應起促進作用，對于攜帶突變型p53的細胞，加溫后突變型p53表達也增加，與加溫產生的熱休克蛋白70協同，對加溫引導的凋亡效應起減弱作用（7，9）。加溫使腫瘤細胞產生細胞周期G1期或S期阻滯，并引發凋亡。具有正常功能的野生型p53可以增強細胞熱效應, 使細胞周期阻滯更延遲和凋亡比例增加，而p53缺失或變異將會減弱或失去這種作用（4、5、6、7、8、9）。

本作者采用本研究所腫瘤分子生物室構建的帶有不同p53狀況的4種人胃腺癌細胞，即通過脂質體介導的野生型p53基因質粒、突變型p53基因質粒、和無p53基因的空載質粒轉移進有p53缺陷的人胃癌BGC－823細胞中，其中帶有野生型p53 的BGC823-wtp53細胞 ( 略為W細胞 )，帶有突變型p53 的BGC823-mutp53細胞 ( 略為M 細胞 )，帶無 p53空載質粒的BGC823－vect細胞 （略為neo細胞）和親本BGC823細胞 （ 略為823細胞 ），用于本實驗。用FCM分析加熱42°C，2h或43°C，30min后，在37°C培養下，8h或16h后，4種細胞的細胞周期再分布和凋亡的比例，結果（見圖3.2.1和表3.2.1）顯示在37°C對照條件下，4種細胞的細胞周期各時相比例都沒有明顯差異。在兩種加溫條件下，在37°C恢復8h或16h后，只有W細胞出現強烈的S期阻滯，在16h后出現明顯的預示凋亡的Sub-G1峰，而其他3種p53異常細胞的細胞周期各時相都沒有發生明顯的變化，也沒有出現Sub-G1峰。43°C，30min兩次加溫4種細胞種植腫瘤，其腫瘤相對體積曲線顯示，W細胞腫瘤生長比其他3種細胞腫瘤更明顯受到抑制（見圖3.2.2 ）。以上實驗結果充分說明，野生型p53促進了加溫所產生的細胞周期阻滯和凋亡，從而明顯地提高了腫瘤細胞的熱敏感性。

圖3.2.1 四種胃癌細胞43°C，30min后16h流式細胞分析圖

A、B、C、D為4種細胞在37°條件下16h，而E、F、G、H為43°C，30min后16h所顯示的G0/G1、S、G2/M期峰的直方圖。只有E圖顯示W細胞在43°C，30min后16h，S期峰明顯增大和在G0/G1峰前出現明顯的Sub－G1峰，預示凋亡出現。

表3.2.1 W細胞和M細胞細胞周期各時相和凋亡的比例

只有W細胞在兩種加溫后8或16小時，S期比例明顯增加，并出現明顯的凋亡分別為10.5%和12.3%。

圖3.2.2 43°C,20min，2次加溫后四種細胞種植腫瘤抑制曲線

顯示只有W細胞腫瘤受到明顯抑制，到20天時僅增大了1倍，

而其他3種細胞腫瘤到20天時增大了2.7~3.6倍，生長速度顯著地高于W細胞。

以上4種細胞感染腺病毒攜帶p53基因 (Adp53) 懸液，如果采用MOI（multiplicity of infection ）100的病毒劑量,可以達到細胞100％感染率和p53蛋白在細胞核內高表達，并產生細胞周期G2/M期阻滯和凋亡以及細胞增殖抑制。Adp53基因的作用不依賴于細胞內在p53狀態。如果以凋亡作為熱效應，Adp53基因感染W細胞或M細胞2天后結合兩種加溫（42°C，2h或43°C，30min）后，Adp53的熱增效比，對W細胞為1.6~3.3,而對M細胞為1.8~2.1。W和M細胞裸鼠后肢種植腫瘤內注射Adp53懸液2天后，行43°C，30min加溫，以腫瘤相對體積曲線顯示，Adp53對W細胞腫瘤的熱增效比為1.16，而對M細胞腫瘤為1.21（12）。通過這種腺病毒介導轉入p53的方法是目前使用最多的基因導入的方法，我們的研究結果也證明：通過P53基因導入，可以有效地重建腫瘤細胞內變異的p53基因，通過延遲G2/M期阻滯和增加凋亡，使腫瘤細胞熱敏感性明顯提高，起到熱增效的作用。今后我們將嘗試通過腫瘤內注射Adp53懸液，結合熱療，來提高腫瘤的熱療療效。

增強治療基因在腫瘤細胞和組織中的表達來提高放療、熱療和化療的效應，是目前關注的亮點。象p53基因導入的策略一樣，用腺病毒攜帶IL-12 ( interleukin-12)或TNFa感染細胞后42°C,30min加溫，使IL-12或TNFa在細胞內表達13600或6.8′105倍升高。腫瘤內注射AD-IL-12后加溫使腫瘤生長明顯受抑制（14）。IL-12或TNFa都是適于熱誘導表達的基因，它們和熱療起協同的作用。

3.3  細胞凋亡

細胞死亡可以分為細胞壞死( necrosis ) 和細胞程序化死亡( PCD, programmed cell death)兩種類型，,后者又稱為凋亡( apoptosis )。該詞源于希臘語，原意為花瓣或樹葉的凋落。細胞壞死是指機體或細胞受到外界強烈的刺激，如物理的低氧、低溫或高溫，以及化學因素損傷時所發生的一種強烈而快速的被動性的細胞死亡過程。最早的形態學特征變化是細胞發生腫脹，胞漿和細胞器都發生腫脹，細胞膜和細胞器膜繼而破潰和消失，最終被水解酶、磷酸脂酶、蛋白酶等消化殆盡。細胞核內染色質先呈為絮狀，繼而整體胞核發生固縮、碎裂和溶解，其變化的基礎是細胞內的蛋白質的變性進而凝固，所以又被稱為凝固性壞死，在水解酶的作用下壞死組織迅速液化，又可稱為液化性壞死。1971年Kerr 提出了有別于壞死的另一種細胞“自殺性”死亡，稱為apoptosis。這是一種細胞主動的，由各種生理或病理性因素誘發或抑制的，并受各種基因調控的編程化死亡過程。它的原意是指發育過程中，定時出現的生理性刺激導致的死亡，是機體為保持細胞內環境穩定的一種自主性的清除過程,是機體內的一種生理過程。與細胞壞死過程截然不同，細胞程序化死亡在形態學上具有獨特的改變。，細胞首先變圓，隨即與周圍細胞連接消失，微絨毛丟失，胞漿濃縮，染色質則濃縮成大小不等的半月狀，并凝聚在核膜周邊，再裂解為小片段，核仁裂解，進而細胞膜內陷將細胞自行分割包裹，形成外有包膜的細胞凋亡小體( apoptosis body )。這些凋亡小體可被鄰近細胞所吞噬清除。細胞凋亡的生物化學特征主要是細胞核內的DNA被核酸內切酶降解，產生若干大小不一的由180個堿基對的整倍數的寡核苷酸片段組成，如在瓊脂糖凝膠電泳上檢測，能觀察到特征性梯狀DNA條帶圖譜 ( DNA ladder )。細胞凋亡過程有新的基因表達和蛋白質合成，因而也是需要能量的過程。細胞凋亡是單個細胞的事件，不發生炎癥反應。凋亡起始于核內DNA的斷裂，壞死起始于膜功能的改變，后期也發生細胞核內DNA降解，兩種壞死以不同途徑和方式，最后“異途同歸”，都進入后階段的繼發性死亡( secondary necrosis )。加溫和輻射、化療藥一樣，都引發細胞的凋亡，通過了解細胞凋亡的調控機制，對于增加熱療對腫瘤細胞的凋亡效應，無疑具有十分重要的意義。

凋亡過程：

細胞濃縮

核染色體濃聚成月牙形、裂解成DNA片段

細胞膜內陷分割

包裹形成凋亡小體

小體被吞噬

壞死過程：

細胞腫脹、破裂

核染色體固縮、裂解

細胞降解、碎片被

吞噬

細胞程序化死亡的機制：

發生程序化死亡的細胞發生各種生物化學以及結構的變化，最早的特征性變化即為細胞內鈣離子濃度的3～5倍的升高，繼而激活一些鈣離子依賴性蛋白酶類，如內源性核酸內切酶 ( endogenous endonuclease )被激活，它從核小體（DNA雙螺旋結構的基本組成單位）連接部位的DNA序列上切割開來，產生的DNA片段都是由180個堿基對的整倍數的寡核苷酸片段。除此之外，作為第二信使的環磷酸腺苷 ( cAMP )在細胞內濃度升高，它通過蛋白激酶A ( PKA, protein kinase A ) 的介導，也參與誘導和調節細胞凋亡。細胞凋亡的最終結果都是細胞染色質DNA片段化特征性的降解，最后產生細胞碎片，形成凋亡小體，被單核－巨噬細胞、或上皮細胞，甚至為腫瘤細胞所吞噬和消化。DNA的片段化，實際上就是DNA雙鏈斷裂不能修復的最終結果，可能就是細胞的真正死因。

細胞程序化死亡是一種由基因表達調控的疾病或生理過程。細胞凋亡的調控基因主要分為兩大類：一類是促進細胞程序化死亡的基因，又稱為細胞自殺基因 ( cell suicide gene ),其中細分為兩個亞類,即細胞凋亡促進基因 (apoptosis-promoting gene ) 和細胞增殖抑制基因 ( proliferation-suppressive gene )，另一類是促進細胞生存的基因，又稱為細胞生存基因 ( cell survival gene ), 同樣也細分為兩個亞類，即細胞凋亡抑制基因 ( apoptosis-suppressive gene ) 和細胞增殖促進基因 ( proliferation-promoting gene )。細胞的生存和死亡，就是這兩類基因正負調控最后平衡的結果。如果細胞凋亡及其相關基因表達水平占上風，就決定了細胞的死亡，反之，如果細胞生存及其相關基因表達水平占上風，就決定了細胞的生存。為了提高熱療對腫瘤細胞的凋亡效應，我們可以人工地提高細胞凋亡促進基因的表達或降低細胞凋亡抑制基因，作為熱療基因調控的新靶點，這是熱療結合基因治療的新策略。下面我們探討一下細胞凋亡調控的幾種主要基因以及它們的調控機制。（圖3.3.2）

p53抑癌基因是一種直接參與細胞凋亡的蛋白質調節基因，起促進凋亡的作用。加溫可以刺激細胞內p53基因的表達短暫升高。熱療誘導細胞凋亡的過程是受p53基因調控的，是一種p53依賴性的過程（4，5，6，7，8，9，10）。p53對細胞凋亡的調控可能與促進細胞膜表面受體Fas/APO1的表達相關。頻發于癌細胞中的原癌基因Bcl-2基因的過表達，可以抑制野生型p53介導的細胞程序化死亡，表明bcl-2是一種細胞凋亡抑制因子，其抗凋亡機制可能與拮抗氧自由基等所引起的細胞氧化有關。Bcl-2也降低了加溫產生的凋亡效應（11）。野生型p53通過其調節作用，即降低Bcl-2基因的表達和同時誘導bax基因（細胞凋亡促進基因）的表達水平升高，來誘導細胞的凋亡。P53蛋白對于bax啟動子具有直接的轉錄激活作用，最終使bax/bcl-2的比例升高是增加細胞凋亡的關鍵。作為癌基因k-ras基因的產物p21/WAF1/ CIP1 蛋白，是細胞周期蛋白D激酶 （ CDK ）的抑制劑，可在轉錄水平上被p53激活，抑制細胞G1/S期的進展，從而引發細胞凋亡，加溫后也證實了p53上調WAF1而誘導凋亡的作用（8）。由此可以看出野生型p53是很重要的凋亡轉錄因子，也是凋亡的效應因子，如果p53發生變異，將失去以上功能，反而成為抑制凋亡的癌基因，突變型p53存在于50%以上人類腫瘤，這是腫瘤細胞熱反應性降低的基因基礎。

除了bcl-2之外，在生長因子缺少的條件下，原癌基因 ( proto-oncogene ) c-myc的表達可以誘導細胞凋亡。加溫誘導腫瘤壞死因子a ( TNFa) 表達增加， TNFa對凋亡起促進作用。

加溫后誘發細胞產生凋亡，有一個引發、發展、高峰、減弱的過程，與加溫溫度和加溫時間呈正相關關系。對于攜帶野生型p53的細胞，加溫后p53表達增加，對加溫引導的凋亡效應起促進作用，對于攜帶突變型p53的細胞，加溫后突變型p53表達也增加，與加溫產生的熱休克蛋白70協同，對加溫引導的凋亡效應起減弱作用（7，9）。

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(中華熱療學會 )